研究背景
已知癌细胞通常通过淋巴系统在区域转移，然后再通过血液系统转移。在这里，作者发现淋巴中的黑色素瘤细胞比血液中的黑色素瘤细胞经历更少的氧化应激且形成更多的转移。患有患者黑色素瘤的免疫功能低下的小鼠和患有小鼠黑色素瘤的免疫功能低下的小鼠，在肿瘤引流淋巴中每微升有更多的黑色素瘤细胞。实验观察到淋巴和血浆之间的多种差异，而这些差异可能有助于减少淋巴的氧化应激和铁死亡，包括更高水平的谷胱甘肽和油酸，以及淋巴中较少的游离铁。油酸以Acsl3依赖的方式保护黑色素瘤细胞免受铁死亡并增加其形成转移性肿瘤的能力。淋巴结黑色素瘤细胞对铁死亡的抵抗力更强，静脉注射后形成的转移比皮下肿瘤黑色素瘤细胞更多。暴露在淋巴环境中可保护黑色素瘤细胞免受铁死亡，并增加了它们在随后通过血液转移过程中生存的能力。实验内容
一、黑色素瘤细胞在淋巴中存活更多
为了比较淋巴和血液中自发转移的黑色素瘤细胞的数量，我们分别对NSG或C57BL小鼠皮下注射人或小鼠的黑色素瘤。实验通过流式细胞术测定肿瘤引流血液和淋巴中黑色素瘤细胞的数量，以及来自同一只小鼠的远血和对侧淋巴。实验观察到，无论是在人或小鼠肿瘤引流淋巴中，每微升的黑色素瘤细胞明显多于肿瘤引流血液中的黑色素瘤细胞（图1a,1b)。实验还检测到黑色素瘤细胞在肿瘤引流淋巴管中转移效率低，而在血液中却更少。这增加了黑色素瘤细胞在淋巴中比在血液中存活更好的可能性。接着实验测试了黑色素瘤细胞在淋巴中的氧化应激是否比在血液中的少。结果证明，黑色素瘤细胞在血液中的传播与ROS的显著增加有关，而在淋巴中的传播则不是，说明黑色素瘤细胞在淋巴中的氧化应激比在血液中的少（图1c,d)。无论是在人体或小鼠中，血液中黑色素瘤细胞总是比淋巴中的黑色素瘤细胞表现出更低的GSH/GSSG（图1e,f)。与结果一致，实验观察到淋巴中GSH（图1g,h)与GSH/GSSG(图1i)的含量高于血液。而且淋巴液中也有较低浓度的8-羟基-2‘-脱氧鸟苷(8-OHdG)氧化产物（图1j)。结果表明血液似乎是一个比淋巴更氧化的环境，这可能解释了血液中黑色素瘤细胞ROS水平增加的原因。二、黑色素瘤在血液中发生铁死亡
对大多数人体和小鼠（图2a,b)的黑色素瘤细胞来说，血液中脂质ROS的水平远远高于皮下肿瘤与淋巴。为了测试黑色素瘤能否发生铁死亡，采用Erastin进行培养（Erastin通过抑制胱氨酸的摄取促进铁死亡），其中加入liproxstatin-1作为参照（通过减少脂质过氧化物的积累来抑制铁死亡）。与对照培养相比，Erastin显著减少细胞数量，而liproxstatin-1阻断了这种效应(图2c,d)。而铁，作为促进脂质ROS产生的因素，是铁死亡所必需的。实验观察到，血浆中游离铁的浓度远高于淋巴（图2e）。为了确定铁死亡是否限制了黑色素瘤细胞在血液中的存活，用载体或liproxstatin-1对黑色素瘤细胞进行预处理，并静脉移植到小鼠体内。与载体预处理相比，liproxstatin-1预处理大大增加了黑色素瘤细胞最有效的的转移性疾病负(图2f,g),而用liproxstatin-1预处理的低效率转移黑色素瘤并不足以增加转移疾病的负担(图2i)。由此可得，铁死亡似乎限制了血液中存活黑色素瘤的有效转移，说明黑色素瘤在血液中发生铁死亡。三、油酸对铁死亡有保护作用
为了更好地理解黑色素瘤细胞为什么是在血液中发生铁死亡，而不是在淋巴中发生，实验皮下移植黑色素瘤，允许它们自发转移，然后使用流式细胞术将同一只小鼠血液和淋巴中的细胞分离再进行代谢组学分析。主成分分析表明，来自淋巴的黑色素瘤细胞聚集在一起，与来自血液的黑色素瘤细胞分离开(图3a)。同时，结果发现，来自同一患者的淋巴和血液中的黑色素瘤细胞与来自不同患者的黑色素瘤细胞相比差异更大。接着，我们对淋巴和血液中黑色素瘤细胞之间不同的代谢物进行了通路富集分析。发现在前五种途径中有三种与脂质代谢有关（图3b)。已知磷脂的脂肪酸组成会影响培养中的癌细胞对铁死亡的敏感度，在检测到的57种脂质中，淋巴和血液中的黑色素瘤细胞之间差异最大的脂质是油酸。油酸是一种单不饱和脂肪酸，通过减少多不饱和脂肪酸的数量或密度来抑制培养中细胞的铁死亡，同时其可用于细胞膜中的氧化。实验表明，油酸在淋巴的黑色素瘤细胞中含量丰富，约为8.7±0.9倍。为了验证油酸对黑色素瘤细胞的影响，实验用油酸或亚油酸（一种多不饱和脂肪酸）处理小鼠和人的黑色素瘤细胞12小时，接着加入erastin（铁死亡激活剂）作用24小时后计数活细胞量。可发现，油酸或亚油酸本身对细胞计数的影响不大，而erastin则显著降低了小鼠和人的黑色素瘤细胞计数。（图3c,d）但当油酸和erastin同时作用于黑色素瘤细胞时，结果发现，油酸显著抑制erastin对细胞的作用，即油酸可保护黑色素瘤细胞免受铁死亡。接下来测试油酸是否能促进黑色素瘤细胞在转移过程中的存活，紧接着用油酸、亚油酸或载体对黑色素瘤细胞进行了12小时的预处理，然后对小鼠静脉注射等量活细胞。实验观察到，相比于用载体或亚油酸处理的人类和小鼠的黑色素瘤，用油酸处理的小鼠的细胞转移负担比较高，说明用油酸进行预处理可以提高大多数黑色素瘤在通过血液转移过程中的存活能力。四、淋巴保护细胞免受铁死亡
根据以上结果，黑色素瘤细胞暴露在淋巴中，通过受油酸或其他抗氧化剂的影响，抑制了自身发生铁死亡的过程，作者提出了淋巴结转移在远处转移之前这一可能性。而为了验证这一点，作者从同一只小鼠的原发性皮下肿瘤和淋巴结转移中分离出小鼠黑色素瘤细胞，并将它们静脉移植到次级受体中。与来自皮下肿瘤的黑色素瘤细胞相比，来自淋巴结的黑色素瘤细胞更有可能形成转移性肿瘤(图3k)。之后为了检验这种差异是否可逆，我们从原发性皮下肿瘤和淋巴结转移中分离出黑色素瘤细胞，然后连续移植细胞，先是皮下，然后静脉注射。结果发现，短暂的皮下生长消除了淋巴结衍生细胞比皮下肿瘤衍生细胞的转移优势。此外，淋巴结转移的黑色素瘤细胞在培养过程中通常比皮下肿瘤的细胞更能抵抗弹性蛋白。(图3l,m)而静脉注射实验表明，癌细胞可以通过血液发生转移，而且显然独立于淋巴，但却比直接通过淋巴转移的效率低得多，特别是在免疫能力强的宿主。大多数黑色素瘤在油酸治疗后会发生更多的转移，但少部分黑色素瘤会通过其他机制在淋巴中免受氧化应激。总的来说，暴露于淋巴环境可保护黑素瘤细胞免于铁死亡，并增加其在随后通过血液转移的过程中存活的能力。Thankyou！
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