作者：张小亚杨小娟张振祺雷萌萌张小彬王晓红杨晓*
中华危重病急救医学,,31(12):-.
重症肺炎是临床常见急危重症，可导致严重的并发症，病死率高达30%～50%，同时也增加了医疗经济负担[1,2,3]。重症肺炎的发生与多种因素有关：患者免疫防御功能障碍；病原菌侵袭下呼吸道，破坏免疫防御机制，或出现*力很强的致病菌；肠道微生态改变。近年来越来越多的研究表明，肠道微生态的改变在肺部感染中发挥着重要的作用[4,5,6]。Dickson等[4]研究显示，脓*症小鼠肺组织富含大量的肠道菌群，比较后发现肠肺菌群有显著相关性，说明肠道菌群是脓*症后肺微生物群中细菌最有可能的来源，移位途径可能通过门静脉循环、全身循环或肠系膜淋巴管，但具体机制仍不清楚。针对重症肺炎患者是否存在肠-肺轴移位以及肠道微生物变化的特点目前仍不清楚。本研究中采用16SrDNA测序技术对重症肺炎患者肠道菌群进行检测及生物学信息分析，与健康人群肠道菌群进行对比，初步探讨重症肺炎患者肠道菌群变化的特点，有助于制定新的预防和治疗策略。
PART01资料与方法1.1 病例的纳入及排除标准：
采用前瞻性研究方法，选择年6月至12月医院重症医学科（ICU）的16例重症肺炎患者作为研究对象〔男性10例，女性6例；年龄42～80岁，平均（62.62±12.80）岁〕，以与重症肺炎患者年龄相匹配的10例健康体检者作为健康对照组。
1.1.1 纳入标准：
符合重症肺炎诊断标准[1]。
1.1.2 排除标准：
①年龄18岁；②近3个月内服用过益生菌或抗微生物制剂；③基础疾病为血液系统疾病及恶性肿瘤患者，并且3个月内有放化疗者；④妊娠；⑤免疫缺陷者；⑥慢性消化道疾病、行胃肠道手术治疗以及存在肛周感染者。
1.2 伦理学：
本研究符合医学伦理学标准，获医院伦理委员会批准（审批号：-），入组前均征得患者或直系家属知情同意，并签署知情同意书。
1.3 标本采集：
收集重症肺炎患者入院2d内自然排便或灌肠所得的粪便标本，健康体检者留取随机粪便，置于粪便盒内，使用液氮罐转运至实验室，于-80℃冰箱保存备用。
1.4 实验方法：
16SrDNA测序由上海慕柏生物医学科技有限公司完成。DNA获取与质检：粪便样本采用化学裂解法裂解细胞膜及细胞核膜，提取DNA，以每个样本提取的DNA为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增16SrRNA基因的V3～V4区域；不同样本的产物按相同比例进行混合，使用IlluminaMiseq平台测序。
1.5 生物学信息分析：
为了研究样本微生物的组成多样性信息，以97%的相似性（Identity）将所有样本的有效序列聚类成为OTU（操作分类单位）。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，通过对比silva数据库采用RDPclassifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，统计各样本的群落组成进行物种注释。通过Mothur软件绘制稀释曲线，得出样本的测序深度情况。采用α多样性分析微生物群落的丰度和多样性，菌群丰度指数包括Ace指数和Chao指数，指数越大表示样本中物种数量越多；多样性指数包括Shannon指数和Simpson指数，Shannon指数越大、Simpson指数越小，说明样本群落多样性越高。采用β多样性分析比较两组微生物群落的差异，采用主坐标分析（PCoA）来显示两组之间的群落结构差异性，如果样本距离越接近，表示物种组成结构越相似，群落结构相似度高的样本倾向于聚集在一起，群落差异较大的样本则会远远分开。对群落差异进行Adonis分析，R2值表示不同分组对样本差异的解释度，R2值越大，表示分组对差异的解释度越高；P值为通过置换检验获得的P值，P值越小，表明组间差异显著性越强。菌群差异菌分析，从门水平和属水平比较每个细菌类群相对含量的差异，采用R软件进行分析。
1.6 统计学方法：
使用SPSS25.0软件对数据进行统计分析。连续性变量均先进行正态性检验及方差齐性检验，分析得出菌群丰度指数及多样性指数均为非正态分布，采用中位数（四分位数）〔M（QL，QU）〕表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。P0.05为差异有统计学意义。
PART02结果2.1 16SrDNA测序结果：
通过对重症肺炎组和健康对照组的粪便样本进行高通量测序后，共得到条有效序列，样本序列平均有效长度为.35bp，总样本平均序列条数为.73条。
2.2 肠道菌群稀释曲线分析：
从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建稀释曲线。从图1可以看出，随着取样量增加，样本菌群OTU趋于稳定，曲线趋向平坦，说明测序数据量足够，基本达到了样本的测序深度。
图1
重症肺炎患者和健康者肠道菌群的稀释曲线
2.3 肠道菌群α多样性分析（表1）：
表1
重症肺炎患者与健康者肠道菌群α多样性比较〔M（QL，QU）〕
重症肺炎组患者Ace指数、Chao指数及Shannon指数较健康对照组显著下降，Simpson指数较健康对照组显著升高（均P0.01），证实重症肺炎患者肠道菌群的丰度和多样性较健康者下降。
2.4 肠道菌群β多样性分析（图2）：
图2
重症肺炎患者和健康者肠道菌群的主坐标分析
PCoA分析显示，健康对照组肠道菌群结构相似度较高，重症肺炎组菌群结构差异较大。Adonis分析显示，重症肺炎组与健康对照组菌群群落结构存在显著差异（R2＝0.，P＝0.05）。
2.5 重症肺炎患者和健康者肠道菌群差异菌分析
2.5.1 门水平差异菌分析（图3；表2）：
表2
重症肺炎患者与健康者肠道菌群门水平比较〔M（QL，QU）〕
图3
重症肺炎患者与健康者肠道菌群门水平及属水平的差异菌条状图
测序OTU共出现8个已知菌门：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门、放线菌门、互养菌门、梭杆菌门、软壁菌门。健康对照组肠道菌群以厚壁菌门和拟杆菌门为主。重症肺炎组厚壁菌门的比例较健康对照组显著下降，放线菌门、互养菌门和梭杆菌门的比例较健康对照组明显增加（均P0.05）。
2.5.2 属水平差异菌分析（图3；表3）：
表3
重症肺炎患者与健康者肠道菌群属水平比较〔M（QL，QU）〕
重症肺炎组有益共生菌属双歧杆菌属、瘤胃球菌属、假丁酸弧菌属、粪球菌属、毛螺菌属、普氏菌属均较健康对照组下降（均P0.05）；机会性致病菌埃希杆菌属、致病菌肠球菌属较健康对照组升高，但差异无统计学意义（均P0.05）；而致病菌梭杆菌属、葡萄球菌属较健康对照组明显升高（均P0.05）。
PART03讨论肠道微生态系统是由多种微生物组成，肠道微生物群稳态是维持宿主健康的先决条件，它能最大限度地实现与宿主共生的相互关系。动物实验表明，肠道菌群除保护肠上皮免受损伤外，还可参与肠道免疫防御机制，有利于抵御肠道病原体的侵袭[7]。先后有学者研究发现，肠道微生态的改变在促进代谢性疾病以及在肝脏疾病的发生发展中发挥着重要作用[8,9,10]。Shimizu等[11]对81例ICU严重全身炎症反应患者肠道菌群的变化进行研究，发现肠道菌群的改变与感染并发症及病死率有关。本课题组前期对脓*症患者肠道菌群研究发现，随病情加重肠道菌群紊乱更加明显[12]。由此可见，肠道微生态紊乱不仅扰乱了正常的肠道功能，更可能导致感染发生和扰乱正常免疫系统促进疾病的发生发展。研究表明肠道的"生态失调"影响着远隔器官肺的健康。Dickson等[4]在脓*症小鼠肺组织中发现肠道菌群，且研究显示肺部菌群与肠道菌群有显著相关性。"肺上有更多的肠道致病菌"的现象在临床上很重要，肠-肺轴的紊乱，肠道菌群可能通过对机体免疫的调节和应答在肺部细菌感染方面起着决定因素[6]。另外，肠-肺轴菌群移位可能在重症患者肺部感染中起关键作用[13,14,15]。因此，对于危重患者肠-肺关系的识别还需要更多的微生物组的研究。
本研究中对重症肺炎患者和健康者粪便样本进行16SrDNA检测，共得到条有效序列，样本序列平均有效长度为.35bp，共得到个OTU。通过肠道菌群稀释曲线分析可见，随着取样量增加，样本菌群OTU趋于稳定，曲线趋向平坦，说明测序数据量足够，基本达到了样本的测序深度。对重症肺炎患者与健康者肠道菌群多样性进行分析，Ace指数和Chao指数代表肠道菌丰度指数；Shannon指数和Simpson指数代表肠道菌群多样性指数。本研究证实重症肺炎组肠道菌群的丰度和多样性较健康对照组下降。本研究通过PCoA分析比较重症肺炎患者和健康者群落微生物成员之间的相关性，更为客观地反映两个群落样本之间的相似程度。结果显示，重症肺炎组与健康对照组菌群群落结构存在显著差异。由此可见，重症肺炎组肠道菌群的丰度及多样性下降，菌群群落结构发生改变，说明在肺部疾病状态下，特别是重症肺炎患者肠道微生物发生改变。健康者肠道菌群表现为多样化的微生物群落，可能会增强宿主的免疫防御能力，而重症患者肠道菌群常以低多样性、关键共生菌低丰度为表现特点[16]。对于危重症患者来说，微生物菌群失调后果很严重，可能加重病情，造成并发症和器官功能障碍。因此，恢复肠道正常微生物的平衡，有利于增强机体免疫防御能力，可能有利于重症肺炎患者疾病的恢复。
健康的肠道菌群具有较高的多样性，厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌群，被认为是健康肠道菌群的普遍特征。本研究显示，重症肺炎组厚壁菌门所占百分比较健康对照组显著下降。厚壁菌门的菌属参与不可吸收碳水化合物和植物纤维的发酵，产生短链脂肪酸（SCFAs）、支链脂肪酸、乳酸、乙醇、二氧化碳和氢气。其中SCFAs是维持肠道黏膜细胞功能的主要能量来源，同时其在肠道微生物研究中被证明对宿主的免疫系统有重要作用。SCFAs包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。而厚壁菌门的主要代谢产物是丁酸盐，丁酸盐发挥广泛的抗炎活动而影响免疫细胞的迁移和黏附、细胞因子表达、细胞增殖与活化、细胞凋亡信号通路的激活及抑制组蛋白去乙酰酶[6,17,18]。因此，厚壁菌门减少势必会造成菌群失调，影响肠道代谢，甚至影响机体免疫力，造成对病原菌清除障碍、感染及炎症持续存在，最终可能会促进疾病的发展。增加高膳食纤维，如益生元可能通过富集产SCFAs菌，增加肠道内SCFAs水平，降低产脂多糖（LPS）菌水平，进而减少LPS入血引起组织器官炎症反应[19]。一项在印度进行的大规模的针对新生儿的随机对照研究显示，口服植物乳杆菌加低聚果糖可减少新生儿脓*症和下呼吸道感染的发生[20]。因此，调控肠道菌群组成，益生元的添加为重症肺炎的治疗提供新思路。
危重症患者肠道菌群紊乱的另一特征表现为有益共生菌属含量下降，致病菌属含量增加。Shimizu等[21]对63例合并全身炎症反应的ICU患者研究显示，胃肠道不耐受患者肠道内双歧杆菌等专性厌氧菌的丰度显著降低，葡萄球菌的丰度显著升高。Yeh等[22]对重症术后患者菌群研究发现，肠道有益共生菌瘤胃球菌属、柔嫩梭菌属、布劳特菌属含量下降，致病菌肠球菌属含量升高。同样，本研究显示，重症肺炎患者有益共生菌属双歧杆菌属、瘤胃球菌属、假丁酸弧菌属、粪球菌属、毛螺菌属、普氏菌属的比例较健康者下降，而致病菌梭杆菌属、葡萄球菌属的比例升高。由此可见，有益共生菌减少，可能会造成机体致病菌属增多。Lankelma等[23]分析发现，单一菌属肠球菌属、葡萄球菌和梭杆菌属等为ICU患者肠道的主要菌属，其含量可占肠道微生物总量的50%以上。Ojima等[24]通过高通量DNA测序分析发现，ICU患者急性期肠道菌群的动态变迁、肠道菌群的显著失调与预后相关。由此可见，致病菌属增多可能加重病情，影响患者预后，干预肠道菌群，益生菌在危重症中使用可能是治疗的新策略。Morrow等[25]的一项随机对照研究显示，给予ICU机械通气患者使用益生菌，鼠李糖乳杆菌可显著降低呼吸机相关性肺炎（VAP）的发生率，证实应用益生菌治疗ICU患者安全有效。重症肺炎患者使用益生菌能否降低异常增高的致病菌，改善预后，仍有待于进一步研究。
综上所述，重症肺炎患者肠道菌群改变表现为菌群的丰度及多样性下降，菌群群落结构发生改变，有益共生菌属减少，致病菌属梭杆菌属、葡萄球菌显著增多。添加益生元和益生菌，恢复正常的肠道微生物平衡可能对疾病的发生带来益处。本研究样本量较少，今后将扩大样本量，进一步研究肠道菌群、机体免疫、肺部疾病之间的关系，肠-肺轴之间的作用机制以及代谢通路，将有助于肺部疾病的预防以及为治疗提供策略。
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