文件导读
弁言
中药抗病*组会
由李忠原同窗为众人分享文件
万石谷，粒粒积聚；
千丈布，根根织成。
01引见
H1N1、SARS-CoV-2等呼吸道病*沾染肺布局后，可释夸大批促炎因子致使病*性肺炎，太过的炎症因子释放引发“炎症因子风暴”毁坏血管内皮细胞，影响气体交流与血管的障蔽功效，引发急性呼吸穷困归纳征，乃至致使沾染者的做古。懂得肺内皮细胞修理的机制，复原血管内稳态从而松开患者病症防止患者做古。年11月25日宾夕法尼亚大学GanZhao,AaronI.Weiner,KatherineM.Neupauer,MariaFernandadeMelloCosta,GargiPalashikar,StephanieAdams-Tzivelekidis,NilamS.Mangalmurti,AndrewE.Vaughan在国际威望学术期刊《SCIENCEADVANCES》颁发了题为“RegenerationofthepulmonaryvascularendotheliumafterviralpneumoniarequiresCOUP-TF2”的文章显露了H1N1沾染肺布局后对肺血管内皮细胞的损伤以及血管内皮细胞的修理机制。H1N1沾染肺布局后向导TNF-α、IL-1β等促炎因子释放，毁坏肺血管内皮细胞，激活NF-кB通路统制COUP-TF2对血管内皮细胞的修理。
02钻研终于
1甲型流感病*（H1N1）向导血管损伤
做家经过VECadCreERT2;lsl-tdTomato小鼠沾染H1N1PR8病*株，考察小鼠血管病变情形，及血管内皮细胞的自我修理情形。终于讲明，H1N1沾染后第10天，肺泡四周毛细血管丛遭到显然损伤，呈现为CD45白细胞的深度浸湿和血管网络的显著毁坏；经过流式细胞术对流感损伤后的内皮细胞停止量化，考察到损伤后第10天和第19天内皮细胞数目显著淘汰，在第27天趋于一般；在沾染后0、7、19、27天对增殖性内皮细胞停止定量（不含白细胞和上皮细胞），在第27天增殖的内皮细胞占比为20%，空白组新增殖的内皮细胞占比为5%，即至罕见15%的内皮细胞是在流感损伤后生成的。经过RAGE记号肺泡上皮细胞，经过Ki67（增殖细胞记号）与EGR（内皮细胞记号）的核共定位判决了增殖的内皮细胞（白色箭头）。流感沾染后12、19、27破晓考察到肺泡上皮和内皮细胞损伤；在沾染的第12天考察到增殖的内皮细胞、19天增殖的内皮细胞显著增长，而在第27天时考察到极多数增殖的内皮细胞，讲明内皮修理历程根底完结。讲明H1N1沾染后能够引发肺血管内皮细胞损伤，且血管内皮细胞具备确定的自我修理手腕。
2损伤后重生血管内皮细胞的根源
做家经过VECadCreERT2;lsl-tdTomato小鼠沾染H1N1PR8病*株，小鼠VECad被记号，若重生内皮细胞来自祖细胞的破裂则不会带记号若重生内皮细胞由原内皮细胞破裂而成则会带记号。经过免疫组化对内皮标识物（CD31），和血管内皮钙粘卵白（VECad）停止染色，终于总共内皮细胞（原有的、重生成的）均具备谱系标签。经过流式细胞术剖析记号内皮细胞的比例，终于沾染前和沾染后30天被记号内皮细胞的比例没有产生改变，讲明存活内皮细胞的破裂增殖是病*性肺损伤后内皮修理的重要机制。该实践为后续深入机制的钻研奠基了基本。
3流感损伤对COUP-TF2内皮细胞的统制影响
在证实肺内皮细胞被病*沾染损伤后能够更生，而且这类更生是由向来存在的内皮细胞破裂增殖而来，做家将重心转向鉴别这类更生形势的分子启动机制-COUP-TF2。做家首先对人肺布局COUP-TF2、PECAM1（CD31，内皮细胞记号）停止染色，讲明COUP-TF2在人肺布局中除动脉除外的大大都肺内皮细胞表率中表白（毛细血管-白色箭头、静脉（白线-小静脉）和淋巴管内皮细胞）。离开肺内皮细胞，经过qPCR对沾染0天、10天、27天的内皮细胞停止COUP-TF2及其靶基因Nrq1、ApoA1、Cyp7a1表白程度探测，终于在流感沾染后COUP-TF2及其靶基因显著下调，在内皮细胞增殖的同时迟缓复原。做家经过免疫组化进一步直觉的示意了COUP-TF2在内皮修理历程的表白情形。在流感沾染后的第12天COUP-TF2的表白下降；在第19天COUP-TF2在内皮细胞增殖的地域中表白（RAGE-）显著增长；在第27天跟着内皮修理根底完结，周全布局中的COUP-TF2表白根底一般化。
4COUP-TF2缺失加剧流感向导的损伤
做家建造COUP-TF2敲除小鼠，首先探测COUP-TF2敲除小鼠的各项体征目标能否一般。终于讲明COUP-TF2敲除小鼠与野生小鼠的体重、血氧饱和度和肺泡灌洗液的总卵白无显著不同；COUP-TF2敲除小鼠肺泡结谈判血管网络清楚完好，但呈现出轻细的肺泡间隙增厚。讲明COUP-TF2敲除后不会引发小鼠肺布局显然的组织及功效改变。做家考证COUP-TF2缺失后会加剧流感向导的肺损伤。在沾抱病*后，COUP-TF2缺失的小鼠体重松开、存活率下降，血氧饱和度下降，肺泡灌洗液中总卵白含量增长，肺内皮细胞的增殖显著淘汰，肺布局也呈现出严峻的损伤、炎症浸湿，严峻的血管间连结中缀，反常血管间距增长，血管密度下降。讲明COUP-TF2在体内血管修理和更生中起着关键的影响。
5促炎细胞因子统制COUP-TF2的表白
经过前方的钻研，COUP-TF2可推进肺内皮修理，但好像自相冲突的是，在流感沾染后初期其表白程度下降。在流感沾染后未几IL-1β、TNF-α等促炎因子会被激烈向导。为了肯定这些细胞因子能否对流感沾染期间内皮细胞的COUP-TF2具备统制影响。做家以IL-1β、TNF-α别离处置iMVECs，经过qPCR、WB探测COUP-TF2RNA及卵白的相对表白量。终于IL-1β、TNF-α可从基因程度及卵白程度统制COUP-TF2的表白。IL-1β、TNF-α是NFkB通路的激活剂，NFkB通路是炎症的一条重要通路，在流感沾染后被激活。因而做家假如这些细胞因子是经过NFkB通路统制COUP-TF2。做家首先经过染色质免疫沉没（ChIP）-qPCR确认了NFkB-p65在COUP-TF2启动子区的联结位点被富集。做家进一步考证IL-1β、TNF-α经过激活NFkB通路统制COUP-TF2。在插足IL-1β、TNF-α以前先插足NFkB通路统制剂BAY11-和JSH-23，插足统制剂后能够逆转由TNF-α及IL-1β致使的COUP-TF2mRNA表白下降。进一步考证，离开肺内皮细胞，经过qPCR对沾染0天、10天、27天的内皮细胞的Nr2f2（COUP-TF2）及NFkB靶基因ICAM-1、VCAM-1、E-selectinmRNA表白量停止探测。终于COUP-TF2与ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的mRNA表白量是相悖的。做家得出论断，IL-1β、TNF-α可激活NFkB通路统制COUP-TF2的表白。
6COUP-TF2是体外血管生成和迁徙所定然的
为了更好地阐述COUP-TF2在体内介导内皮更生的机制，做家再次转向利用iMVECs（人肺微血管内皮细胞）的体外实践。做家生成了编码Cas9和针对COUP-TF2基因关键组织域的多个导向RNA的慢病*转入iMVECs，致使COUP-TF2的卵白表白险些全部缺失。由于血管生成修理被觉得波及到细胞迁徙，做家经过迁徙实考证实COUP-TF2（KO）细胞迁徙受损；经过CCK8法对野生型iMVECs及COUP-TF2（KO）的iMVECs停止生机测定，终于COUP-TF2敲除后细胞生机下降。经过EdU染色探测增殖性iMVECs的百分比，终于敲除COUP-TF2后增殖性iMVECs比例淘汰。为了操纵iMVECs长生化的任何影响，做家进一步考证了COUP-TF2在原代iMVECs中的推进增殖及迁徙影响。做家在原代iMVECs细胞中转染COUP-TF2的小做梗RNA缄默COUP-TF2，终于COUP-TF2缄默后可统制细胞的迁徙且COUP-TF2缄默后增殖性iMVECs比例淘汰。做家经过对野生iMVECs及COUP-TF2（KO）的iMVECs停止基因测序，终于讲明不同表白的基因重要富集在血管发育、细胞迁徙、增殖和黏附方面。做家经过反向考证COUP-TF2高表白时能否会推进细胞的增殖。终于COUP-TF2高表白后细胞生机增加，可推进细胞迁徙且增殖性iMVECs比例增长。
7COUP-TF2经过直接与启动子联结激活Ccnd1和Nrp1介导血管修理
COUP-TF2能够经过在不同细胞处境中直接联结靶基因启动子表现转录激活子或统制子的影响。经过芯片剖析COUP-TF2可直接与Ccnd1和Nrp1的启动子地域联结；经过qPCR及WB剖析，COUP-TF2敲除后，Nrp1和Ccnd1表白均下调，讲明COUP-TF2直接结兼并激活Nrp1和Ccnd1的转录。为了钻研COUP-TF2的缺失能否松开了VEGFA/VEGFR2记号介导的血管生成就应，做家评价了VEGFA向导的细胞增殖和迁徙对COUP-TF2的依赖性。iMVECs在插足及不插足VEGFA的情形下造就24、48和72小时，并评价其增殖情形。终于讲明COUP-TF2缺失轻细但显著松开了VEGFA对iMVECs的增殖影响。并经过迁徙实践证实插足VEGFA可推进细胞迁徙，但在COUP-TF2低表白时即使插足VEGFA仍然会统制细胞迁徙，讲明COUP-TF2缺失松开了VEGFA对iMVECs的推进迁徙影响。尽管高表白COUP-TF2能够推进iMVECs的增殖及迁徙手腕，然而无奈经过插足VEGFA进一步增加。这大概是由于Ccnd1的直接上调或细胞周期激活统制了Nrp1/VEGFR2记号的任何额外的推进有丝破裂影响。利用取舍性Nrp1统制剂ATWLPPRPeptideTFA（APT）阻断VEGFA与Nrp1的联结，可很大程度统制iMVECs迁徙但没有显著性不同，阻断Nrp1与VEGFA联结后对细胞增殖的影响较小且没有显著性不同。这些终于讲明，COUP-TF2介导的增殖在很大程度上依赖于Ccnd1，而Nrp1大概对细胞迁徙有更大的影响。做家进一步研讨VEGFR2依赖性记号能否受COUP-TF2影响。经过VEGFA处置IMVEC30分钟，汇集细胞，经过WB探测VEGFR2磷酸化。COUP-TF2的缺失下降了Tyr处VEGFR2的磷酸化，而COUP-TF2的太过表白稍微增加了VEGFR2的磷酸化。以上终于讲明COUP-TF2推进Nrp1的转录，其影响是夸大VEGFA向导的血管生成：Nrp1与VEGFA联结后，与VEGFR2造成复合物，推进VEGFR2磷酸化，从而激活下游血管生成记号通路，推进内皮细胞迁徙和增殖。COUP-TF2的缺失致使Nrp1表白下降，从而统制Nrp1/VEGFR2介导的血管生成。
03小结
该文显露了H1N1、SARS-CoV-2等呼吸道病*沾染肺布局后对肺血管内皮细胞的损伤及其修理的机制。H1N1、SARS-CoV-2等呼吸道病*沾染肺布局后可造成肺部血管内皮细胞的损伤，这类损伤的修理主若是依靠于COUP-TF2激活下游靶点Ccnd1、Nrp1增加VEGFA/VEGFR2记号介导的血管生成就应，而该修理机制的拦阻重要根源于病*对炎症通路NFкB的激活。该文为诊疗呼吸道病*沾染供给了一个新方位。
原文链接
