北京中科白癜风医院三级专科 https://wapyyk.39.net/hospital/89ac7_guides.html急性T淋巴细胞白血病(T-cellacutelymphoblasticleukemia,T-ALL)和T淋巴母细胞淋巴瘤(T-celllymphoblasticlymphoma,T-LBL)是具有高度侵袭性的T系恶性肿瘤。由于正常T细胞和恶性T细胞之间共有的抗原性，目前仍然缺乏针对T细胞恶性肿瘤的获批CAR-T疗法。
CD7在T-ALL/LBLT细胞表面高度表达，是潜在的CAR-T治疗靶点。既往研究发现，虽然CD7在不同阶段的自然杀伤细胞和的正常T细胞上表达，但敲除CD7的小鼠仍然可产生正常免疫功能，这表明CD7对于T/NK细胞的发育和功能或许不会造成影响。
靶向CD7的免疫疗法可能会受到T细胞自相残杀机制（fratricide）的影响。因此，在既往研究中曾采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和蛋白沉默表达技术生产靶向CD7的CAR-T细胞。但是，基因编辑技术会使得CD7CAR-T细胞的生产成本增加。此外，使用患者自体T细胞制造CD7CAR-T细胞仍然具有一定难度。虽然供者来源或通用型CD7CAR-T是一种选择，但寻找合适的供体、异体CAR-T在体内扩增能力及持续时间等问题仍有待解决。
年5月2日，医院陆佩华团队、河北森朗生物科技有限公司李建强团队、医院*晓*团队合作在Blood发表了题为NaturallySelectedCD7CAR-TTherapywithoutGeneticManipulationsforT-ALL/LBL:First-in-humanPhaseIClinicalTrial的研究论文（第一作者：陆佩华、刘莹）。该研究使用了患者或供者来源的，无需额外CD7基因编辑或蛋白质表达阻断的“自然选择（NaturallySelected）”CD7CAR-T细胞(NS7CAR)的新产品，并在1项针对T-ALL/LBL患者的1期临床试验中（NCT）首次探索了NS7CAR疗法在人体内的安全性和有效性。
NS7CAR临床前研究
在临床前研究中，研究者首先构建了由CD7特异性小鼠单克隆抗体(TH69)cDNA序列、12AA短铰链结构域融合到CD28TM-41BB-CD3ζ信号域的编码序列和T2A连接的tEGFR所构成的7CAR基因盒。接下来，研究者使用三种不同的方法制造了靶向CD7的CAR-T细胞并比较它们的功能：1)NS7CAR：通过用7CAR转导总T细胞，然后对其进行“自然选择”的细胞培养方式获得；2)Neg7CAR：由天然存在的CD7阴性T细胞（占CD3+T细胞的3%-10%）用7CAR进行纯化和转导后进行生产；3)KO7CAR：通过将7CAR转导到使用CRISPR/Cas9RNP敲除CD7基因的总T细胞进行制造。
研究者观察到，在2周的培养期间内，NS7CAR的细胞扩增倍数显著低于Neg7CAR和KO7CAR的扩增倍数；然而，有87.3%的NS7CAR是活细胞，使得进一步研究成为可能。值得注意的是，在收获时，NS7CAR组中平均92.4%的T细胞表达7CAR分子，显著高于Neg7CAR或KO7CAR（p0.)。在7CAR慢病*转导三天后，NS7CAR组中的T细胞发生了从CD7+CAR-到CD7-CAR+的快速而显著的表型转变。一个有趣的发现是，尽管NS7CAR组中的T细胞在体外培养后用FCM未检测到CD7的表面表达，但使用RT-PCR和WesternBlot检测到了显著的CD7mRNA和蛋白质的表达。与此同时，在Neg7CAR或KO7CAR细胞中未观察到CD7mRNA或蛋白质表达。这些结果表明，尽管NS7CAR表达CD7mRNA和蛋白质，但它们在免疫学上是CD7阴性的，并由于CD7CAR的抗原隐蔽/细胞内隔离作用而逃脱了自相残杀的细胞杀伤机制。这一点在随后的临床研究中，在CAR-T回输后第28天检测到患者体内NS7CAR中CD7mRNA的表达持续存在而被进一步证实。此外，相比Neg7CAR和KO7CAR，NS7CAR包含较多的CD8+亚群和中央记忆表型亚群。
在体外抗白血病实验中，NS7CAR和KO7CAR对CCRF-CEM细胞均表现出相当的细胞*性，并释放高水平的IFN-γ和TNF-α，但Neg7CAR细胞的相应数值较低。在动物实验中，在CAR-T注射后的前两周内，NS7CAR和KO7CAR均可显著降低小鼠模型中的白血病负担。这些数据证明了无需额外的基因编辑，直接由7CAR转导的总T细胞产生有效的CD7CAR-T的可行性。因此，研究者在1期临床试验中使用NS7CAR-T细胞，进一步探索其有效性和安全性。
NS7CAR临床研究
在I期临床研究中应用了来源于患者或其移植供者的NS7CAR产品。对于未接受过异基因移植的患者，使用自体CAR-T细胞；对于入组时为移植后复发状态的患者，在对患者进行综合评估后确定使用患者自体或移植供者来源的CAR-T细胞。在年11月至年9月期间，共入组和回输20名复发或难治性(R/R)T-ALL/T-LBL患者，其中包含14名R/RT-ALL患者及6名R/RT-LBL患者。3名患者为Ph阳性或ETP-ALL高危亚型；11名患者存在高危突变或基因融合。5名患者在入组前接受过移植。患者接受了中位数为4.5线的治疗。入组时，17名患者的骨髓肿瘤细胞比例中位数为21.49%；有3名T-LBL患者髓内未见肿瘤细胞。分别有5位T-LBL和4位T-ALL患者有髓外病灶，其中3名有中枢受累。
所有患者的NS7CAR产品均成功制备（自体来源，n=18；供者来源，n=2），中位转染效率为95.10%。NS7CAR产品有更多的CD8+亚群，中位CD4/CD8比例为0.42。通过FCM和qPCR检测，均未发现NS7CAR终产品污染。在Day0，分别3、16和1名患者接受了低剂量（0.5×/kg）、中剂量（1-1.5×/kg）或高剂量（2×/kg）的单次NS7CAR回输。
NS7CAR展现出了良好的安全性和耐受性。1名患者未出现CRS;18名患者的CRS≤2级，仅有一名患者出现3级CRS。2名患者发生1级ICANS。
同时，NS7CAR也在临床实验中体现了良好的疗效。在Day28时，16/17(94.12%)的骨髓受累患者实现了MRD阴性完全缓解（CR）或CR伴血液学不完全缓解（CRi）；3名仅有髓外病灶的T-LBL患者也继续保持了髓内CRi的状态。在9名有髓外病灶的患者中，5名在中位时间29天时达到髓外CR。两名有巨大纵隔肿物（7cm）的患者在第29天分别达到髓外部分缓解（PR）和疾病稳定（SD），其中PR患者在第天时，其髓外病灶进一步缩小。两名有中枢神经系统浸润的患者也分别在第15天和第28天达到CR。至研究截止日期（.10.25），所有患者的中位随访时间为.5天。6/20名患者在CAR-T细胞回输后未接受额外的抗白血病治疗或移植，其中4人在54天的中位时间保持无疾病进展。在回输后中位时间57.5天，10名CR患者接受了巩固性桥接移植；移植后中位随访时间为天，7/10名CR患者在移植后保持MRD阴性并持续生存。两名患者因个人原因出组，出组时均处于CR。一名患者进行了二次移植，发展为3级aGvHD，随后去世。有4名未达到CR或CR后复发的患者接受了挽救性移植并全部达到CR。
研究者对NS7CAR的体内细胞动力学进行了分析。NS7CAR扩增起始于回输后中位数4.5天。CAR中位峰值拷贝数为1.37×copies/μgDNA，达到峰值的中位时间为19天。在末次随访时，NS7CAR+DNA中位持续时间为90天；在移植后中位时间39.5天，12/14名患者仍可通过qPCR检测到水平较低的NS7CAR+DNA。对于未桥接移植的6名患者，CAR-T细胞在末次随访中仍可检测到，中位持续时间为48.5天。用FCM检测的NS7CAR中位峰值比例为67.76%，最高比例达84.71%；中位峰值时间为17天。
NS7CAR回输后，患者外周血中恶性和正常CD7+细胞的最显著减少发生在回输后中位时间第7天。在CAR-T扩增高峰，每位患者的T/B/NK细胞（不包括CAR+和白血病T细胞）的绝对数量均显示出不同程度的短暂下降。NS7CAR迅速消灭了CD7+细胞，并主要保留了CD7阴性细胞亚群。T/B/NK细胞随后恢复到基线水平，但就如所预期的，在移植后不久出现下降。在移植后，正常的CD7+T细胞和NK细胞得到充分恢复。
总之，该研究揭示了通过“自然选择”机制生产靶向CD7CAR-T细胞的方法(NS7CAR)。研究者发现，虽然FCM无法检测到NS7CAR-T细胞表面上的CD7分子，但NS7CAR-T细胞继续表达CD7mRNA和蛋白质的水平虽然稍低，但与正常对照T细胞中的水平是可比的。研究认为，NS7CAR-T细胞的CD7分子很可能被CD7CAR抗原掩盖或在胞内隔离。最小化来自于NS7CAR-T的可用表面CD7抗原避免了自相残杀。不能排除在体外“自然选择”过程中，少部分NS7CAR-T细胞从自相残杀中出现的可能性。这使得NS7CAR-T与真正的CD7阴性的Neg7CAR-T或KO7CAR-T细胞形成对比。研究者提出，许多NS7CAR-T细胞本身并不是CD7阴性，而是功能性CD7阴性。因此，研究者提出假设：由于CAR信号可能需要蛋白质复合物形成，CAR-T细胞通过NS7CAR-T细胞表面的游离CD7CAR与靶向T细胞上表达的CD7之间的相互作用被激活，而胞内CD7-CD7CAR复合物不能激活T细胞。与Neg7CAR和KO7CAR细胞相比，细胞内CD7CAR-CD7相互作用是否导致CAR信号减弱,并导致NS7CAR细胞体外扩增程度降低仍待确定。其次，自相残杀是否在NS7CAR减少扩增中发挥了作用还有待进一步研究。
在该研究中，NS7CAR在体外和体内均表现出强大的抗肿瘤作用。NS7CAR的首次人体临床试验表明，无需额外的基因编辑即可防止CD7表达，并成功生产NS7CAR-T细胞。总体而言，NS7CAR对治疗R/RT-ALL/LBL是安全且高效的。进一步评估NS7CAR-T细胞疗法需要纳入更多患者并延长观察周期。
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